2014年末，《Nature Methods》杂志将年度技术授予了激光层照荧光显微技术）。同时，杂志也介绍了2015年值得关注的技术，包括DIA质谱、微小晶体的结构、深度成像以及新一代CRISPR等。

 

      2015值得关注的技术之一：激光层照荧光显微技术

 

      激光层照荧光显微技术能以很高的3D分辨率，长时间对生物学样本进行温和成像。这一技术结合高速相机，足以捕捉细胞或亚细胞水平发生的动态。日前，《Nature Methods》杂志将这个低光毒性的快速三维成像技术评为了2014年的年度技术。

 

      激光层照荧光显微技术的基本原理很简单，它不像宽场或共聚焦显微镜那样照射或扫描整个样本，而是用薄层光从侧边照射样本，然后从样本的上部或下部检测荧光，激发光路与检测光路垂直。激光层照荧光显微镜激发一个层面上的荧光基团，一次成像一个面，这种技术不仅大大降低了光毒性，还提高了长时间成像活样本的能力。

 

      Light-sheet技术始于一百年前，原本是用来成像胶体的。后来，Ernst Stelzer等人用这一技术成像了荧光标记的活斑马鱼胚胎，Light-sheet技术由此重新焕发了活力。Stelzer在本期Nature Methods杂志上撰文，介绍了这一技术的起源、原理和应用潜力。

 

      激光层照荧光显微技术的崛起，离不开荧光蛋白和转基因标记的发展。实际上，只有物理学、生物学等多个领域进行跨学科合作，人们才能充分挖掘出这一技术的潜力。随着商业化仪器的不断推出和升级，相信激光层照技术将为我们揭示以往难以想象的生物学细节。

 

      2015值得关注的技术之二：DIA质谱

 

      传统的蛋白质组学采用数据依赖采集（DDA）策略，将蛋白质样品消化成肽段，离子化并通过质谱进行分析。在全扫描质谱图中，高于噪音的肽段信号被选择性裂解，产生随机（MS/MS）质谱，能够与数据库中的图谱相匹配。尽管这种方法非常强大，但它随机抽取肽段进行裂解，总是偏向于那些信号最强的峰。因此，低丰度肽段的定量仍是挑战。

 

      早在两年前，《Nature Methods》就将年度技术颁给了靶向蛋白质组学技术。在最成熟的定向分析技术——选择反应监测（SRM）中，质谱仪能非常灵敏地检测到特定肽段，具有高的定量准确性。然而，这种方法并不适合于发现型的应用。

 

      因此，蛋白质组研究界如今将目光集中在数据非依赖采集（DIA）上，它在理论上综合了DDA和SRM的优势。在DIA分析中，指定质荷比（m/z）窗口内的所有肽段都经过裂解；分析重复，直至质谱仪覆盖整个m/z范围。这实现了准确的肽段定量，而不限于分析预先定义的肽段。

 

      尽管DIA的概念早在十年前就被引入，但直到最近开发出一些实际的DIA应用，它才重新点燃了人们的兴趣。蛋白质组学领域的许多科学家都看到了DIA的潜力，认为它有望解决DDA所面临的问题，但其他人并没有留下深刻的印象。《Nature Methods》的编辑AllisonDoerr认为，也许DIA还需要进一步应用到更具挑战性的生物问题，才能展示它的优势。

 

      2015值得关注的技术之三：深度成像

 

      要全面了解器官或组织的结构和功能，最好是在其完整状态下进行研究。正因如此，透视器官深处一直是生物学家的一大梦想，现在能实现这一梦想的技术已经触手可及。

 

      一般来说，要对不透明的生物样本进行深度成像是非常困难的。为了克服这个问题，人们开发了许多“透明化”方法。CUBIC、iDISCO和PACT都能使固定样本的组织透明化，并且保留荧光标记的信号。这样的技术将会渗透到多个领域，为人们解决各种各样的问题。（延伸阅读：Cell：透明小鼠实现系统生物学终极梦想）

 

      不过，上述透明化技术并不适合活体样本。在这种情况下，我们需要通过其他途径来减少样本的光散射和提高透明度。举例来说，我们可以使用非线性激发（比如双光子显微镜）或者近红外光成像，近红外光在生物组织上有较深的穿透能力。最近人们还开发了遗传学编码的近红外探针和纳米颗粒，特别适合非侵入性的癌症研究和活细胞追踪。更长波长的成像技术，将实现更深的组织穿透。

 

      2015值得关注的技术之四：微小晶体的结构

 

      大家都知道，通过X射线衍射确定原子结构时，首先你得有大的、结构良好的蛋白质晶体。这说来容易做来难。许多蛋白质，尤其是膜蛋白，无法形成大的晶体，往往形成纳米或微米大小的晶体。在几年前，这种微小的晶体基本上被认为是没用的，因为在衍射数据记录之前它们就会受损。不过，新的技术如今也能从这些晶体上获得高质量的数据。 

 

      一种方法是飞秒X射线晶体学，其中微小的晶体涌入飞秒脉冲的路径，这些脉冲来自极其明亮的X射线自由电子激光装置（XFEL）。X射线的脉冲非常快，因此在晶体被破坏之前就能收集衍射图像。自2011年引入这项技术之后，它经过快速发展，并不断扩大应用范围。

 

      2014年，这项技术带来了新的结构和见解，并不断改进将微小晶体引入XFEL光路以及数据分析的方法。去年，亚洲地区唯一拥有XFEL的研究机构——日本理化学研究所发表了一些生物学成果。而在未来几年，德国和瑞士XFEL设施的建设也有望完成。   

 

      2015值得关注的技术之五：新一代CRISPRs

 

      当人们提到所谓的使能技术），类似印刷机的发明，或者麻醉药的发现就会浮现在我们脑海中。而对于科学家来说，CRISPR-Cas9系统就是这样一种系统。

 

      这种细菌免疫系统能通过将病毒DNA中的短重复片段整合到细菌基因组中，来抵抗病毒。当细菌（或其后代）第二次感染病毒的时候，这些重复序列就能通过一种核酸酶靶向侵入的互补DNA，并摧毁它。

 

      2013年几个研究组就利用了这一系统编辑真核生物基因，随后看到在不少应用中CRISPRs迅速崛起，多个不同物种都实现了基因组中基因删除和插入，激活或抑制基因转录。但是随着这一系统越来越受欢迎，关于其特异性和有效性的质疑也越来越多。

 

      如何提高导向RNA（gRNA）的特异性是一大问题，这种RNA能将Cas9核酸酶带领到基因组目标位置，Nature Biotechnology杂志建议切断gRNAs（Nature子刊：巧解基因编辑脱靶问题），减少脱靶问题，而且不影响靶标活性，而另外一个研究组则建议更长一些的gRNAs。

 

      这明显是有些自相矛盾的建议，前者的研究人员指出只是简单截短了gRNA靶标区域的长度，结果发现在之前检测到的脱靶位点，脱靶突变都大幅减少，与全长gRNA相比，一些位点的突变频率甚至减少了5，000倍以上。重要的是在靶向它们的预定目标DNA时，这些缩短了的gRNA（称为tru-gRNA）与全长gRNA同样有效。而后者则发现选择合适的靶标序列，优化gRNA和Cas9，就能避免或者减少脱靶突变的出现。另外一个问题是如何筛选脱靶，以及中对于研究的影响有多少。可以验证gRNAs错配候选位点的方法也许会错失一些关键的剪切位点，而且全基因组测序也不是非常有效，目前我们需要一种敏感且无偏差的方法，来标记Cas9靶标位点，并令它们能在整个基因组中被识别出来。

 

      其它的令这一系统特异性更强的方法还有，用配对替换切口酶（nickases）替换Cas9核酸酶（前者每次只能切断DNA一条链），或者将Cas9突变融合到Fok1这种需要催化激活的核酸酶中去。此外，通过来自不同物种的Cas9也能增加靶向多个位点的灵活性，进一步改善Cas9-gRNA复合物的传递系统，也有助于增加效率。

 

      尽管Cas9潜力无限，但是这还是一种细菌的蛋白，对于一些应用，尤其是临床上的应用来说，还需要寻找真核生物核酸酶进行替换。对于植物来说，一些Argonaute核酸酶能通过小RNAs靶向DNA，这也是基因组编辑可以考虑的一个方向。